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Determinação
de insulina
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Carlos
A.C. Sannazzaro (Professor Doutor da FCF-USP), Silvia
Cardoso (Farmacêutico-Bioquímico do Lab.
FAP)
Erika Taga (Farmacêutico-Bioquímico
do Lab. FAP), Adelaide José Vaz (Prof. Associado
da FCF-USP) |
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Insulina humana – estrutura
e secreção
A insulina é o principal hormônio responsável
pelo controle do metabolismo da glicose. É sintetizada
nas células beta das ilhotas de Langerhans, assim
como o seu precursor a proinsulina (9,6 Kda, 86 aminoácidos).
A proinsulina é então secretada nos grânulos
secretores, para formar o peptídeo C e a insulina.
A insulina é um polipeptídeo que contém
duas cadeias ligadas por pontes dissulfito. A cadeia A
com 21 e a B com 30 aminoácidos. A insulina e o
peptídeo C são secretados em quantidade
equimolar na circulação portal. Na circulação
humana, o tempo de meia-vida da insulina é de aproximadamente
3-5 minutos.
Quase todos os tecidos metabolisam a insulina, mas 80%
são degradadas no fígado e rim. De fato,
50% da insulina são degradadas no fígado.
Como as proteínas e o peptídeo C não
são agregados pelo fígado eles se acumulam
no sangue e contabilizam 15-20% da quantidade total de
insulina e proinsulina no estado basal. A glicose é
o primeiro sinal de estímulo de secreção
de insulina. Assim é recomendável a dosagem
de ambas para uma interpretação correta
da medida de insulina. |
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Uso clínico
da determinação da insulina
A principal utilidade da determinação da
insulina é a investigação das causas
de hipoglicemia. A hipoglicemia pode ser devido ao hiperinsulinismo,
insulinoma, síndrome da insulina auto-imune ou
por fatores não mediadores da insulina. Hipoglicemia
é geralmente definida com base na concentração
plasmática de glicose (< 3,3 – 2,8 nmol/l ou
70 – 105 mg/dl em adultos e < 3,0 – 2,5 nmol ou 60
–100 mg/dl em crianças).
A determinação do peptídeo C é
importante porque pode excluir a suposição
de interferência analítica ou hipoglicemia
induzida, causada pela administração de
insulina animal ou humana. Também é necessário
determinar as proinsulinas as quais podem estar em sua
forma molecular predominante de insulina na circulação.
Os valores que indicam secreção anormal
de insulinas, estão contidas no Quadro 1:
Quadro 1 – Critério para diagnóstico
de hiperinsulinemia reativa (associada a hipoglicemia
e outros sintomas)
| Insulina |
Peptídeo
C |
Proinsulinas |
| Dosagem não-específica |
Dosagem específica |
| > 5 – 10 mlU/l |
> 2 – 3 mlU/l |
>0,2 – 0,3 nmol/l |
> 5 – 10 nmol/l |
Fonte: SAPIN, R. – Insulin assays – When
and how shoud they be perfomed – Clin. Lab. Int.,
v. 15, n. 4, p. 6-8, 2001.
A tolerância diminuída a glicose (IGT= Impaired
Glucose Tolerance) e diabetes mellitus são diagnosticados
com base na hiperglicemia crônica. A medida da insulina
é usada no estudo destas patologias.
No diabético tipo 1 – a insulina pode ser útil
nos estudos farmacológicos. O tipo 2 resulta de
uma resistência a insulina associada a um defeito
de secreção da insulina. Dosagens específicas
de insulina são usadas para determinar a deficiência
relativa de insulina e a incapacidade do pâncreas
em compensar a resistência à insulina, por
uma adequada secreção de insulina. A determinação
da insulina tem o valor clínico no diagnóstico
de resistência severa a insulina. Associada à
determinação do peptídeo C, a medida
da insulina pode ser usada para acessar a função
das células beta especialmente nos casos recém-diagnosticados
de Diabetes tipo 1. Ela também é importante
para diferenciar os Diabetes do tipo 1 dos Diabetes do
tipo 2. |
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Métodos de determinação
de insulina
Ensaios biológicos in vivo somente
são usados nas etapas de padronização.
A cromatografia líquida de alta eficiência
- fase reversa (RP-HPLC), atualmente denominada FR-CLAE,
é utilizada para separar: proinsulina, insulina
e peptídeo C, mas não é utilizada
como método de referência. Os métodos
mais comumente usados nos laboratórios são
os imunoensaios.
O radioimunoensaio (RIE) para insulina foi desenvolvido
por Yalow e Berson utilizando anticorpos policlonais e
insulina marcada. Soros policlonais podem apresentar reação
cruzada com proinsulinas, e por esta razão esses
testes são considerados não-específicos.
Há um teste RIE insulino-específico. LINCO-RIA
(LINCO Rsearch INC., Missouri, USA), que usa anticorpo
para um epítope específico da insulina da
porção amino-terminal da cadeia A.
O desenvolvimento da tecnologia de produção
de hibridomas secretores de anticorpos monoclonais permitiu
a obtenção de anticorpos mono-específicos
para uso como reagente analítico. Ensaios imunométricos
não-competitivos (IMA= Imunometric Assay) tipo
sanduíche foram introduzidos usando dois tipos
de anticorpos, geralmente policlonais de captura em fase
sólida e monoclonais conjugados com substâncias
não-isotópicas, como enzima. Essas gerações
de ensaios são consideradas específicas
e, geralmente mais sensíveis que o RIE. |
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Padronização:
A calibração dos testes de determinação
da insulina é realizada usando um padrão
internacional. Em muitas determinações é
usada a velha preparação de referência
de insulina humana 66/304. Para converter as unidades
internacionais em unidades de massa, podemos fazer pelo
primeiro padrão internacional (codificado com 83/500),
o qual contém insulina humana semi-sintética
com uma potência de 26 unidades internacionais por
mg.
Os valores de insulina pela metodologia IMA são
20-40% mais baixos que os obtidos por RIA, devido à
menor especificidade deste último. A Americam
Diabetes Association, vem propondo a uniformização
de métodos a partir de um método de referência,
o que ainda não ocorreu. |
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Requerimentos das amostras:
Para os ensaios de insulina, a amostra de sangue pode
ser coletada com ou sem anticoagulante (Heparina ou EDTA
para a maioria dos ensaios, exceto para aqueles que usam
fosfatase alcalina como enzima marcadora do conjugado).
Amostras de plasma para a determinação de
insulina podem ser estocadas por 3 dias a 20º C, duas
semanas a 4º C e alguns meses a-20º C. Congelamentos e
descongelamentos repetidos não interferem significativamente
nos resultados. |
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Hemólise:
A enzima que degrada a insulina (IDE = insulin-degrading
enzyme) presente nas hemácias é liberada
no soro quando ocorre hemólise. A extensão
do efeito da hemólise na determinação
da insulina depende de condições como o
tempo e a temperatura de incubação. Mesmo
pouca hemólise em amostras à temperatura
ambiente pode provocar um decréscimo acentuado
nos valores de insulina. A hemólise pode fornecer
um resultado com valores anormalmente altos de insulina,
mas mais freqüentemente é a causa de resultados
falsamente baixos.
No passado, resultados alterados de insulina em pacientes
com tumores de tecido eram interpretados como sendo devidos
a alguma substância contida nos tumores. Atualmente
sabe-se que estes resultados se devem a alta concentração
de IDE nos tumores liberada na circulação.
O EDTA não inibe a degradação da
insulina em plasma hemolisado. Talvez a adição
de inibidor de IDE mais potente como N-etilmalimido e
ácido p-cloromercurifenilsulfônico, 1 mM,
possa prevenir a degradação da insulina,
mas não é comum seu uso. |
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Anticorpos antiinsulina:
Anticorpos séricos antiinsulina interferem nas
determinações de insulina. Estão
presentes em pacientes com síndrome auto-imune
e freqüentemente em diabéticos insulino-tratados,
mesmo quando fazem uso de insulina recombinante humana.
Cerca de 30% dos pacientes diabéticos do tipo 1
tem anticorpos antiinsulina antes da administração
de insulina e 50% dos pacientes diabéticos tratados
com insulina humana desenvolvem estes anticorpos. |
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Determinação
da insulina livre:
Anticorpos antiinsulina devem ser removidos da amostra
antes da determinação da insulina livre.
Isto é usualmente obtido pela precipitação
dos mesmos como polietilenoglicol (PEG). Após centrifugação,
a insulina livre é determinada no sobrenadante.
É recomendado que a precipitação
com PEG seja feita com o soro ou plasma fresco, recém
obtido, para que se respeite o equilíbrio nativo
entre insulina livre e ligada. |
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Critério de eleição
do método analítico:
Os métodos imunométricos são preferidos
na rotina no laboratório clínico pela maior
sensibilidade e especificidade. Já o RIE pode ser
usado quando se deseja a medida total de insulina secretada,
como nos casos de insulinoma.
Obs.: Este trabalho foi adaptado do original:
Sapin, R. – Insulin Assays – When and how should they
be performed – Clin. Lab. Int., vol. 15, n.4, p. 6, 8,
2001. |
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Referências Bibliográficas:
CHEVENNE, D.; TRIVIN, P.D. Insulin assays and reference
values. ....................Diabetes Metab. 1999; 25:459-76;
CLARK, P.M. Assays for insulin, proinsulin(s), and C-peptide.
Ann. Clin. .............Bicohem, 1999; 36:541-64;
SAPIN, R. Recent insulin inmunoassys: improvements and
limits. J. Clin. ...........Ligand Assays, 1996; 19 (Supp
1): 100-1
SAPIN, R. Insulin assays – When and how should they be
performand-. .............Clínical Laboratory International,
vol. 15, n. 4, p. 6-8, 2001. |
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Pesquisa de insulina
oral na forma de cápsulas é promissora
Durante estudos na Fase 1, doses únicas de insulina
comercial apresentadas na forma de cápsula foram
bem toleradas por voluntários saudáveis
- sem efeitos colaterais significativos. Os responsáveis
pelo desenvolvimento deste método de administração
acreditam que a insulina em forma oral pode satisfazer
a condições de tempo, localização
e concentração necessários para sua
administração eficaz em casos de diabetes.
A experiência foi conduzida por médicos de
uma unidade de diabetes da Hadassah University (Ein Kerem,
Israel). Existem planos para uma futura realização
de testes de acompanhamentos dessa experiência com
insulina oral em pacientes diabéticos.
A insulina oral utilizada é uma tecnologia nova
de administração desenvolvida pela Emisphere
Technologies (Tarrytown, NY, EUA; www.emisphere.com).
A tecnologia é de base ampla, baseada no desenho
e preparação de compostos químicos
sintéticos, denominados agentes administradores,
ou transportadores, que facilitam a absorção
gastrintestinal de moléculas da droga pela imitação
do processo de transporte natural do corpo. As moléculas
da droga existem naturalmente em diferentes formatos ou
configurações, algumas das quais podem ser
transportadas através das membranas das células.
Uma vez atravessada a membrana celular pela droga, o transportador
se dessocia da droga, e esta restabelece sua distribuição
natural de absorção, garantindo que as moléculas
absorvidas estão no seu estado terapêutico
ativo.
A insulina administrada via oral é levada diretamente
ao fígado pela via portal da circulação,
contrastando com a insulina injetada que é concentrada
na circulação sistêmica. A insulina
absorvida oralmente imita o rápido aumento e diminuição
na secreção de insulina em resposta à
alimentação. Sendo oral, a insulina é
levada diretamente ao fígado, e espera-se que isso
represente mais segurança. A Emisphere também
está desenvolvendo um fragmento do hormônio
da paratireóide (PTH) oral para tratamento da osteoporose,
e heparina oral para até 30 dias de uso nos casos
de tromboses profundas (DVT).
"Os resultados deste estudo são muitos encorajadores
sendo o primeiro passo para entregar ao comércio
uma formulação oral da insulina", declarou
o Prof. Norman Fleischer, do departamento de endocrinologia
da Albert Einstein School of Medicine (New York, NY; EUA).
"Aguardamos os estudos adicionais que não somente
provarão que a administração da insulina
oral é possível, mas que esta é uma
terapia viável para os que sofrem de diabetes em
todo o mundo."
Fonte: Biotech News International, Vol. 6 No. 5,
9/10/2001. |
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