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Práticas
de laboratório para diagnóstico da malária
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| Por Anthony
Moody e David Manser |
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INTRODUÇÃO:
A malária é um sério problema de
saúde mundial. Anualmente, são infectados
200 milhões de pessoas e 2 milhões morrem
da doença. Apesar do aumento do número de
terapias e métodos de controle, continuamos longe
de controlar a doença. A chave para a redução
da taxa de mortalidade é um diagnóstico
rápido e uma terapia eficaz. Apesar da microscopia
ser considerada o padrão-ouro para o diagnóstico
e monitoramento do tratamento da malária, essa
técnica exige pessoal treinado e experimentado
no exame de distensões sanguineas. Novas técnicas
científicas estão sendo empregadas para
desenvolver diagnósticos simples, eficazes, capazes
de serem realizados fora do laboratório. Espera-se
que a utilização desses testes venha a possibilitar
diagnósticos rápidos nas comunidades locais,
assegurando o tratamento imediato e eficaz para prevenir
a disseminação da doença. |
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| A malária infecta
mais de 200 milhões de pessoas no mundo, dos quais
morrem 2 milhões. Um diagnóstico rápido
e o tratamento precoce dos casos clínicos é
essencial para a redução da taxa de mortalidade
por malária. O monitoramento da eficácia
do tratamento antimalárico é igualmente
decisivo. Isso exige controle da eliminação
dos parasitas para que se possa detectar precocemente
qualquer recrudescimento da doença devido às
variedades resistentes aos medicamentos, iniciando-se
um tratamento igualmente precoce com vistas a prevenir
complicações e deter a propagação
da doença. O atraso no diagnóstico e a demora
no tratamento são os motivos por que se associa
essa elevadíssima taxa de mortalidade à
malária do P.falciparum. O problema é
ainda mais agravado pela redução da sensibilidade
às drogas pelo parasita da malária, particularmente
o P.falciparum, e pelo aumento na transmissão
da malária em algumas regiões do mundo,
enquanto escasseiam as medidas para controle do vetor
e sua resistência aos pesticidas. Atualmente, o
P.falciparum é virtualmente intratável
pela cloroquina na maior parte do mundo. Muitas variedades
do P. vivax também são resistentes
à droga. O quinino é a droga preferida para
o tratamento da malária resistente a cloroquina,
mas a toxicidade da mesma e o não seguimento da
prescrição médica são problemas
que persistem. Novas drogas antimalária (e.g. Artenusate,
Malarone, Mefloquine) são caras e nem sempre eficazes.
Já existe alguma resistência a essas novas
drogas. |
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Diagnóstico da
malária no laboratório
A administração eficaz de um caso de malária
exige o diagnóstico imediato, seguido do tratamento
precoce apropriado. O tratamento com drogas deve ser monitorado
para assegurar a detecção precoce de quaisquer
falhas no tratamento que possam resultar em complicações
e na propagação continuada de variedades
resistentes às drogas. Deve-se então escolher
um tratamento alternativo. É mundialmente aceita
a necessidade de diagnosticar melhor a malária.
O teste ideal para o diagnóstico da malária
deve ser simples, rápido, de fácil interpretação,
sensível (capaz de detectar níveis bastante
baixos de parasitemia, e.g. numa população
imune em áreas endêmicas, em infecções
subpatentes e recrudescentes), e específico, particularmente
quanto ao P. falciparum. O teste deve ser adequado
para uso em espécimes frescos ou preservados (desidratados
ou congelados), e possivelmente formatado para uso em
equipamentos automáticos de análises clínicas.
Também deve ser possível a obtenção
de resultados quantitativos (parasitemia) para o monitoramento
do tratamento por drogas. Qualquer teste disponível
deve ser de baixo custo para uso em áreas endêmicas
onde a doença prevalece. |
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Microscopia de distensão
sanguínea
Historicamente, a pedra fundamental para o diagnóstico
da malária tem sido a microscopia de distensões
sanguíneas espessas e finas. Essa técnica
continua sendo o método mais econômico e,
independente do progresso que se está alcançando
com métodos não-microscópicos para
o diagnóstico da malária, a microscopia
continuará sendo por muitos anos uma importante
técnica diagnóstica. O diagnóstico
microscópico é um procedimento sensível,
de custo reduzido, que pode fornecer informações
valiosas ao médico atendente, tanto para fins terapêuticos
como para o acompanhamento clínico. O treinamento
de um microscopista no reconhecimento e identificação
de espécies de parasitas da malária, assim
como para contribuir com informações capazes
de influenciar o modo de aplicação e a droga
a ser ministrada, é uma tarefa muito exigente,
que requer empenho, paciência e habilidade. A microscopia
não deve ser desprezada ainda que outros métodos
não-microscópicos estejam disponíveis. |
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Microscopia de distensão
sanguínea
Historicamente, a pedra fundamental para o diagnóstico
da malária tem sido a microscopia de distensões
sanguíneas espessas e finas. Essa técnica
continua sendo o método mais econômico e,
independente do progresso que se está alcançando
com métodos não-microscópicos para
o diagnóstico da malária, a microscopia
continuará sendo por muitos anos uma importante
técnica diagnóstica. O diagnóstico
microscópico é um procedimento sensível,
de custo reduzido, que pode fornecer informações
valiosas ao médico atendente, tanto para fins terapêuticos
como para o acompanhamento clínico. O treinamento
de um microscopista no reconhecimento e identificação
de espécies de parasitas da malária, assim
como para contribuir com informações capazes
de influenciar o modo de aplicação e a droga
a ser ministrada, é uma tarefa muito exigente,
que requer empenho, paciência e habilidade. A microscopia
não deve ser desprezada ainda que outros métodos
não-microscópicos estejam disponíveis. |
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Distensão sanguínea
‘espessa’ (gota espessa)
A distensão sanguínea espessa proporciona
uma camada de 3 a 5m l
de sangue numa área de 1 cm2. É
corada com corante não fixado de Fields ou Giemsa
(Romanowsky). Uma distensão espessa é 15
a 20 vezes mais sensível do que a distensão
sanguínea fina equivalente e responde pela sensibilidade
da técnica microscópica. Nas mãos
de um microscopista experiente, uma densidade de parasitas
da ordem de 5 a 50 parasitas/m
l (0,001%-0,0001% parasitemia) pode ser detectada. No
entanto, pela experiência da UKNEQAS [United Kingdom
National External Quality Assessment/Avaliação
Nacional da Qualidade Externa no Reino Unido] para Parasitologia,
um nível de 50 a 500 parasitas/m
l (0.01-0.001%) é mais realista para a maioria
dos laboratórios. O exame de 200 campos de distensão
sanguínea espessa é o método padrão,
e o seu uso pode acelerar a rapidez no diagnóstico
e melhorar a sensibilidade de detecção do
parasita em várias casas decimais, em comparação
com distensões sanguíneas finas. A microscopia
que utiliza distensões sanguíneas espessas
pode ser empregada para diagnóstico e triagem de
estágios de gametas. Adicionalmente, a maior sensibilidade
da distensão sanguínea espessa permite detectar
quaisquer indícios iniciais de alterações
na morfologia parasitária ou a falha em erradicar
o parasita após uma terapia adequada, o que pode
sugerir uma possível resistência à
droga ou o recrudescimento da infecção. |
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Distensão sanguínea
‘fina’
As distensões sanguíneas finas produzem
uma monocamada de eritrócitos na lâmina e
são coradas com corante Giemsa após a fixação.
A distensão fina possui elevada especificidade
e o reconhecimento preciso do estágio do parasita
da malária, permitindo determinar sua espécie.
Relatar o número de hemácias (RBCs)
parasitadas pelo P. falciparum (parasitemia) é
uma outra ferramenta que permite ao médico decidir
sobre a severidade potencial da infecção,
particularmente em pacientes não-imunes, e influencia
a escolha da droga e a via de administração.
O exame correto de uma distensão sanguínea
fina que tenha sido corado leva pelo menos 20 minutos.
O reconhecimento e relato dos estágios mais tardios
do trofozoíto do P. falciparum podem fornecer
indicadores valiosos para o clínico sobre um possível
envolvimento cerebral.
Os trofozoítos tardios do P.falciparum contém
cromatina expandida e um citoplasma mais espesso que é
freqüentemente vacuolado (figura 1). Inclusões
de hemácias (fenda de Maurer [Maurer’s cleft])
também são visíveis. Adicionalmente,
um pequeno aglomerado de pigmento marrom dourado de hemozoína
é encontrado em posição oposta
ao único ponto de cromatina do núcleo. Os
estágios esquizontes do P.falciparum são
identificáveis pela divisão da cromatina
em diversas partes e uma massa única e grande de
pigmento hemozoína. As hemácias parasitadas
são muitas vezes ‘desemoglobinizadas’. O exame
diário de distensões sanguíneas finas
para a verificação de parasitemia fornece
valiosa indicação de terapia bem sucedida
ou de possível fracasso na terapia medicamentosa.
Parasitas inviáveis podem permanecer em circulação
junto com parasitas viáveis e poderiam, portanto,
estar presentes numa parasitemia. Tem sido relatada a
diferenciação por fluorocromos entre parasitas
viáveis e inviáveis com Rhodamine 123. O
laranja acridina e o Benzociocarboxipurina são
dois fluorocrômos que têm afinidade com a
cromatina do núcleo do parasita, e têm sido
empregados nos procedimentos de coloração
de parasitas da malária com uso de uma fonte de
luz UV. Eles constituem um método microscópico
sensível para a detecção de parasitas
da malária, mas carecem da capacidade de especificar.
O controle da qualidade de todos os corantes e procedimentos
de coloração é boa prática
de laboratório. |
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Testes baseados em antígenos
Toda técnica empregada no diagnóstico da
malária deve atender a determinados critérios
técnicos e igualar, ou exceder, o desempenho do
método atualmente aprovado (O Padrão-Ouro).
Deve ser sensível, precisa e fácil, exigindo
pouco treinamento do operador e da capacidade de interpretar.
Para substituir um procedimento aprovado por um método
novo, é necessário que este forneça
aos médicos resultados igualmente aceitáveis.
Os Testes de Diagnóstico Rápido (TDRs) que
fazem uso do princípio da imunocromatografia estão
se tornando uma alternativa viável para o exame
microscópico de distensões sanguíneas
finas/espessas (figura 2). Os testes atuais disponíveis
para malária empregam antígenos de três
parasitas detectáveis distintos: Histidine Rich
Protein 2 é um antígeno do P. falciparum
encontrado em abundância. Também são
usados o lactato dehidrogenase e a aldolase parasita-específicos.
Um terceiro componente é usado no BINAX ‘NOW’ ICT,
mas ainda não foi divulgado. |
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O que podem fazer os
TDRs atuais?
Os atuais TDRs podem ser utilizados. com sensibilidades
variáveis, para detectar o P.falciparum
isolado ou o P.falciparum com ‘outros’ antígenos
da espécie Plasmodium. Todos dão
um resultado em prazo compatível (20 minutos) e
não há correlação direta entre
a densidade visual da linha de captura e a parasitemia
calculada a partir da distensão sanguínea
fina. Os TDRs que usam o HRP2 para o reconhecimento do
P falciparum não distinguem entre antígenos
de parasitas viáveis e inviáveis em circulação.
Contudo, os TDRs que medem a atividade enzimática
do parasita indicam a presença de parasitas viáveis
exclusivamente. |
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PCR – uma alternativa
válida para o diagnóstico da malária?
Foram desenvolvidos numerosos ensaios baseados em PCR
(Polymerase Chain Reaction/Reação
em cadeia de polimerase) para o diagnóstico da
malária. Vários estudos demonstram que a
PCR tem sensibilidade e especificidade maiores do que
a distensão sanguínea fina (figura 3). A
técnica é muito útil quando há
necessidade de examinar com precisão um grande
número de amostras como, por exemplo, em diversos
estudos epidemiológicos; em experiências
clínicas, terapêuticas e de imunização;
na triagem de doadores de sangue e na detecção
de vetores assintomáticos em áreas endêmicas.
A PCR é também uma ferramenta muito útil
no diagnóstico de infecções mistas,
no monitoramento da resposta do paciente a drogas antimalária,
e na caracterização de genótipos.
Numerosos alvos de DNA têm sido empregados em ensaios
baseados em PCR. A pequena subunidade de gene (SSU) rRNA,
com seus sítios gene-específicos e espécie-específicos,
tem sido empregada na diferenciação de espécies
plasmodiais de PCR (Snounou et al 1996). Também
têm sido investigadas as regiões espécie-específicas
do gene da proteína ‘circumsporozoíta’.
A PCR também está se tornando uma ferramenta
cada vez mais importante no monitoramento do tratamento
medicamentoso. Os métodos que dependem de testes
de suscetibilidade in vitro são de emprego
limitado porque exigem equipamentos e perícias
consideráveis, e com freqüência produzem
resultados inconsistentes. Nem todos os parasitas podem
ser adaptados à cultura in vitro, e os métodos
microscópicos não são suficientemente
sensíveis para detectar níveis muitos baixos
de parasitemias resultantes de tratamentos curativos ou
subterapêuticos (parasitemias subpatentes ou infecções
recrudescentes). |
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Automatização
usando pigmento Hemozoína
O pigmento hemozoína é produzido pelo parasita
da malária ao digerir a hemoglobina do eritrócito.
O seu uso como possível alvo para diagnóstico
com o emprego de gráficos de dispersão produzidos
por analisadores de contagem sanguínea tem sido
discutido, (Parasitology Today, vol. 16, 2000). A possível
presença contínua do pigmento hemozoína
nos monócitos por períodos consideráveis
após a cura originam diagnósticos falso-positivos,
em particular nas áreas endêmicas. Contudo,
esta será uma área interessante para desenvolvimento
futuro. |
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Conclusão
A distensão sanguínea corada ainda é
de uso extensivo e prático no diagnóstico
de rotina da malária e atualmente não pode
ser superado como o padrão-ouro para diagnóstico.
Contudo, alguns TDRs podem proporcionar a sensibilidade
e a especificidade necessárias para substituir
a microscopia, assim que tiverem sido vencidos os problemas
de estabilidade e custo. Espera-se que, eventualmente,
todo centro de saúde possa diagnosticar a malária,
ensejando o diagnóstico e o início de tratamento
eficaz precoces. Isso terá um papel vital na redução
do número de óbitos por esta doença. |
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Anthony Moody e David
Manser são do Department of Clinical Parasitology,
Hospital for Tropical Diseases, University College of
London Hospital (UCLH), London, UK.
Email:anthony.moody@uclh.org |
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