2 - METODOLOGIAS DE COLORAÇÃO

MÉTODO DE COLORAÇÃO À QUENTE – MÉTODO DE ZIEHL-NEELSEN

1. Preparar um esfregaço homogêneo, delgado e identificado em uma lâmina nova desengordurada, limpa e seca;

2. Deixar secar à temperatura ambiente;

3. Fixar o material  do esfregaço passando 3 a 4 vezes pela chama do bico de Bunsen;

4. Cobrir a totalidade da superfície do esfregaço com solução de Fucsina fenicada, previamente filtrada ou filtrado sobre a lâmina no momento da coloração;

5. Deixar agir por cerca de 5 minutos, aquecendo brandamente utilizando algodão umedecido em álcool ou com a chama do bico de Bunsen, passando lentamente por baixo da lâmina, até que se produza emissão de vapores e, quando estes são visíveis, cessar o aquecimento. Repetir essa operação até completar três emissões sucessivas. Evitar  a fervura e secagem do corante (adicionar mais corante, se preciso, dentro deste período para evitar que a lâmina seque porque o esfregaço precisa estar coberto permanentemente durante o aquecimento.).  Este aquecimento deve ser intermitente, pois é importante manter a solução aquecida durante o tempo previsto;

6. Lavar em água corrente para eliminar a Fucsina. Toma-se a lâmina pelo extremo numerado, inclinar para frente e lavar deixando cair um jato d’água de baixa pressão sobre a película corada, de maneira que essa não se desprenda;

7. Cobrir toda a superfície do esfregaço com a solução de Álcool-ácido. Tomar a lâmina entre o polegar e o indicador e fazer um movimento de vai-e-vem, de modo que o Álcool-ácido vá descorando suavemente a Fucsina. Se o esfregaço estiver ainda com a cor vermelha ou rosada, descora-se novamente. Considera-se descorado o esfregaço, quando suas partes mais grossas conservarem somente um ligeiro tom rosado. Essa operação dura, em geral, dois minutos;

8. Terminada a fase de descoloração e eliminado o Álcool-ácido, lavar a lâmina da mesma forma como se procedeu depois da coloração com a Fucsina, com cuidado para não desprender a película;

9. Cobrir toda a superfície do esfregaço com solução de Azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto;

10. Lavar, da mesma forma como se indicou para a Fucsina, tanto o esfregaço como a parte inferior da lâmina;

11. Colocar a  lâmina com o esfregaço para cima, sobre o papel limpo, para secar à temperatura ambiente ou estufa a 35º C;

12. Observar ao microscópio com objetiva de imersão (100 x).

MÉTODO DE COLORAÇÃO À FRIO – MÉTODO DE KINYOUN

1. Preparar um esfregaço homogêneo, delgado e identificado em uma lâmina nova desengordurada, limpa e seca;

2. Deixar secar à temperatura ambiente;

3. Fixar o material  do esfregaço passando 3 a 4 vezes pela chama do bico de Bunsen;

4. Cobrir a totalidade da superfície do esfregaço com solução de Fucsina fenicada ( Kinyoun ), previamente filtrada ou filtrado sobre as lâminas no momento da coloração, deixando agir por cerca de 5 minutos, adicionando mais corante se preciso dentro deste período, evitando que a lâmina seque;

5. Lavar em água corrente para eliminar a Fucsina. Toma-se a lâmina pelo extremo numerado, inclinar para frente e lavar deixando cair um jato d’água de baixa pressão sobre a película corada, de maneira que essa não se desprenda;

6. Cobrir toda a superfície do esfregaço com a solução de Álcool-ácido. Tomar a lâmina entre o polegar e o indicador e fazer um movimento de vai-e-vem, de modo que o Álcool-ácido vá descorando suavemente a Fucsina. Se o esfregaço estiver ainda com a cor vermelha ou rosada, descora-se novamente. Considera-se descorado o esfregaço, quando suas partes mais grossas conservarem somente um ligeiro tom rosado. Essa operação dura, em geral, dois minutos;

7. Terminada a fase de descoloração e eliminado o Álcool-ácido, lavar a lâmina da mesma forma como se procedeu depois da coloração com a Fucsina, com cuidado para não desprender a película;

8. Cobrir toda a superfície do esfregaço com solução de Azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto;

9. Lavar, da mesma forma como se indicou para a Fucsina, tanto o esfregaço como a parte inferior da lâmina;

10. Colocar a  lâmina  com o esfregaço para cima, sobre o papel limpo, para secar à temperatura ambiente ou estufa a 35º C;

11. Observar ao microscópio com objetiva de imersão (100 x).

Observação:

1. Na coloração do Mycobacterium leprae , segue-se o mesmo procedimento mas a descoloração deve ser feita com Ácido sulfúrico a 4% em água, pois esse microrganismo é sensível a descoloração alcoólica.
2. Ao realizar uma coloração de esfregaço, em qualquer método, alguns procedimentos devem ser observados a fim de  evitar cometer erros por utilizar:
a. substâncias corantes não certificadas;
b. substâncias corantes precipitadas;
c. corantes com concentração inadequada;
d. esfregaços demasiados espessos, concentrados ou delgados;
e. metodologia incorreta.

Na preparação dos corantes de Fucsina fenicada (Ziehl – Neelsen e Kinyoun), dissolver em um gral o corante (Fucsina) no Álcool etílico 95º, juntar aos poucos o Fenol fundido. Misturar sempre de modo a obter uma solução bem homogênea. Juntar a água, pouco a pouco, lavando o gral. Filtrar após 24 horas de repouso. Estocar em frasco escuro.

Segundo Langeron, a prática seguida por outros autores de misturar a solução alcoólica saturada do corante com água fenolada não dá soluções tão estáveis e dotadas de poder corante tão intenso como esta técnica descrita acima.

Observação:

Para manter o fenol fundido, adicionar-lhe 15% de água destilada. Desta solução (de água em fenol) , na fórmula acima, tomar 5,75 ml.

4.1.b. Álcool-Ácido:

Com uma pipeta deixar escorrer o Ácido clorídrico pelas paredes do frasco contendo o Álcool e agitar suavemente.

Observação:

Alguns autores recomendam Álcool-Ácido à 1%.

4.1.c. Azul de metileno: